细胞转染是将外源核酸(DNA、RNA 或 siRNA 等)导入细胞内，以研究基因功能、蛋白质表达或进行基因编辑的关键技术，广泛应用于基础研究、药物研发及基因治疗等领域。

一、实验原理

细胞转染的核心是突破细胞膜的屏障作用，使外源核酸进入细胞并发挥生物学功能。细胞膜由脂质双分子层构成，具有选择透过性，通常阻止大分子物质(如核酸)自由进入。转染技术通过物理、化学或生物手段暂时改变细胞膜的通透性，或借助载体将核酸包裹后穿过细胞膜。进入细胞的外源核酸可通过不同途径发挥作用：DNA 可整合到细胞基因组中稳定表达，或在细胞质中瞬时表达；RNA(如 mRNA、siRNA)则直接在细胞质中参与翻译或基因沉默过程。

二、常用转染方法

(一)脂质体介导法

将核酸与阳离子脂质体混合形成复合物，通过脂质体与细胞膜的融合作用将核酸送入细胞。该方法操作简便、适用性广(适用于多数贴壁细胞和部分悬浮细胞)，转染效率较高，且对细胞毒性较低，是实验室最常用的转染方法之一。但成本较高，且受血清、离子浓度影响较大。

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(二)电穿孔法

利用高压脉冲电场在细胞膜上形成瞬时微孔，使核酸通过微孔进入细胞。适用于各种类型细胞(包括原代细胞、悬浮细胞等难转染细胞)，但对细胞损伤较大，可能导致细胞存活率下降，且需要专用电穿孔仪器。

(三)病毒介导法

将外源核酸包装到病毒载体(如慢病毒、腺病毒、逆转录病毒)中，通过病毒感染细胞将核酸导入。该方法转染效率极高，尤其适合原代细胞和干细胞，且可实现稳定表达，但操作复杂，存在生物安全风险(需在相应等级的生物安全实验室进行)，且病毒载体构建周期较长。

(四)磷酸钙共沉淀法

将核酸与磷酸钙形成沉淀复合物，通过细胞内吞作用进入细胞。成本低廉，但转染效率较低，且受 pH 值、温度等因素影响较大，目前已逐渐被脂质体法替代。

三、实验操作步骤(以脂质体介导法为例)

细胞准备：选择对数生长期的细胞(如 HEK293、CHO 细胞)，接种于 6 孔板中，每孔约 2×10⁵个细胞，加入 2mL 含血清的完全培养基，置于 37℃、5% CO₂培养箱中培养，待细胞汇合度达到 70%-80% 时进行转染(汇合度过低或过高均会影响转染效率)。

转染复合物制备：在无菌离心管中，用无血清培养基(如 Opti-MEM)稀释核酸(DNA 浓度通常为 0.5-2μg / 孔)，轻柔混匀;另取一离心管，用同样的无血清培养基稀释脂质体试剂(按核酸：脂质体 = 1:2-1:5 的比例，具体比例需根据预实验确定)，室温静置 5min;将稀释后的核酸与脂质体混合，轻轻吹打混匀，室温孵育 15-20min，形成稳定的转染复合物。

转染操作：将细胞培养板中的旧培养基吸出，用无血清培养基轻轻冲洗细胞 1-2 次;向每孔中加入 1mL 无血清培养基，然后缓慢滴加制备好的转染复合物，轻轻晃动培养板使复合物均匀分布;置于培养箱中培养 4-6h 后，弃去含复合物的培养基，更换为含血清的完全培养基继续培养。

结果检测：根据实验目的选择检测时间(瞬时转染通常在 24-72h 后检测，稳定转染需筛选单克隆细胞株)。可通过荧光显微镜观察报告基因(如 GFP)表达情况，或采用 Western blot、qPCR 等方法检测目的基因的表达水平。

四、注意事项

细胞状态把控：确保细胞活力良好(活细胞率 > 90%)，无支原体污染;传代次数过多会导致细胞特性改变，建议使用低代次细胞(<30 代);接种密度需适中，避免细胞过度拥挤或稀疏。

试剂选择与处理：脂质体需避光保存，使用前平衡至室温;核酸纯度需高，避免蛋白质、RNA 酶等杂质污染(可通过紫外分光光度计检测 A260/A280 比值，DNA 应在 1.8 左右，RNA 应在 2.0 左右);无血清培养基需新鲜配制，避免变质。

转染条件优化：不同细胞对转染试剂的敏感性不同，需通过预实验优化核酸浓度、核酸与脂质体比例、转染时间等参数;对于易受血清影响的细胞，可在转染期间使用无血清培养基，转染后换回含血清培养基。

避免污染与毒性：操作全程需在超净工作台进行，严格无菌操作;脂质体浓度过高会导致细胞毒性，表现为细胞变圆、脱落，需控制在合适范围内;转染后若细胞状态不佳，可缩短转染时间或降低试剂浓度。

结果验证：除观察报告基因表达外，需结合多种方法验证转染效果，如检测目的蛋白的表达量(Western blot)、mRNA 水平(qPCR)或功能学实验(如细胞增殖、凋亡检测)，确保外源核酸有效发挥作用。

细胞转染实验的成功与否取决于细胞状态、试剂选择、操作规范等多方面因素，通过合理优化实验条件，可显著提高转染效率，为基因功能研究及相关应用提供可靠的技术支持。

发布于：山东省